季也蒙毕赤酵母菌尿酸酶基因的克隆、重组表达及表征

分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》

饶菁菁 景一娴 邹明月 胡小蕾 廖飞 杨晓兰

摘要： 目的：克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因，并通过重组表达和表征进行确认。方法：测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种，串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白，测定转录组验证其诱导表达属性，据季也蒙毕赤酵母ATCC 6260基因组信息推断所得尿酸酶(Uniprot id: A5DFP1)的编码序列设计引物，从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因，测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU，同时构建无6His标签的表达质粒R-MGU。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶，SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子量，以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质，并与天然尿酸酶进行比较。结果：rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母，串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5DFP1高度相似，转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达。用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列，T载体测序显示其与A5DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同。SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa；MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43kDa且与天然酶一致，但按氨基酸序列计算分子量仅33.98 kDa，表明其可能存在化学修饰。重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0 U/mg；R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子量与天然尿酸酶无差别，但R-MGU很难纯化，使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。结论：成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶，并实现其活性形式的重组表达。

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