分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶，具有酶切效率高，特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵，操作复杂，限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术，合成基因ulp1（Leu403-Lys621），并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6），构建重组表达载体psvT7-ulp1，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主，转接后7 h加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为16 h，最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%，重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L，通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应，测定酶活为5.19 U/μl，比酶活为5.23×104 U/mg，是先前报道比酶活的1.87倍，通过酶活动力学分析，Ulp1的表观米氏常数 Km=0.359 g/L，Vm=5.10μg/(mL·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment，scFv）的表达，得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白，使用表达的Ulp1进行酶切并纯化，获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单，显著改善了scFv在大肠杆菌中难于高效可溶性表达纯化的现状。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶，前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS），可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖，从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径，通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA，分别转化原菌TP-02和△ugp突变株，构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分，发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱，而同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右，而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究，发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示，UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体，而GDPG可能是UDPG的替代物，在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外，利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析，经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300，为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用烟草遗传转化体系，研究尾叶桉（Eucalyptus urophylla）咖啡酸氧甲基转移酶基因（EuCOMT）和咖啡酰CoA氧甲基转移酶（EuCCoAOMT）基因对木质素单体合成的定向调控效果。方法：分别利用EuCOMT的正义片段、EuCCoAOMT的全长RNAi片段进行单基因和二价基因的烟草转化研究，并对转基因烟草植株中目标基因表达水平、木质素和纤维素的含量、茎部解剖结构以及木质素单体含量进行检测。结果：分别获得了转基因植株C-S（转EuCOMT正义片段）、CR（转EuCCoAOMT全长RNAi片段）、C-CR（EuCOM和EuCCoAOMT二价基因转化）。烟草中转入的正义EuCOMT的片段能够正常表达，而EuCCoAOMT的全长RNAi片段对烟草CCoAOMT基因引发了强烈的抑制。转基因烟草的生长形态、木质素、纤维含量以及解剖结构与野生型无显著差异。转基因植株C-S中G木质素含量升高17.72%，S/G比值降低17.99%；CR中S/G比值升高61.62%，C-CR中G木质素降幅达到57.38%，S/G比值升幅达到114.94%。结论：抑制CCoAOMT对G木质素合成具有显著的抑制效果，EuCOMT和EuCCoAOMT二价基因转化对S/G比值的定向调控效果最为理想。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：通过优化PET11b-sTNFαRI 5’ mRNA翻译起始区（TIR）二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))中的表达水平。方法：通过对PET11b-sTNFa RI mRNA 5’端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析，设计相应的引物对mRNA 5’翻译起始区（TIR）相应密码子进行突变，从而使核糖体结合位点（RBS）及起始密码子（AUG）暴露于发夹结构之外，此外将pET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA，以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5’端TIR区优化后的序列与sTNFαRI序列一起克隆到pET11b载体中，并转化大肠杆菌BL21（DE3），阳性转化子经IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：通过对PET11b-sTNFa RI 5’TIR mRNA二级结构优化， 经SDS-PAGE和Western-blot分析表明重组sTNF αRI的表达水平较优化前提高50-60%。结论：通过对重组载体翻译起始区（TIR）mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平，对进一步工业化生产具有重要的应用价值。
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