分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-12-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P>0.05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P<0.01)和囊胚率(P<0.05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P<0.01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P<0.05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2022-03-30 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant,LEA)与植物抗逆性密切相关,在干旱胁迫下保护植物细胞,减少植物损伤,并广泛存在于生物体内。垫状卷柏(Selaginella pulvinata)是一种在干旱胁迫下生存能力极强的蕨类植物,具有很强的恢复能力。为探究垫状卷柏SpLEA1基因在耐旱植物中的分子机制与表达特征,该研究以高耐旱性植物垫状卷柏为实验材料,基于转录组测序结果,采用RT-PCR技术获得SpLEA1基因cDNA序列,采用HiTail-PCR技术获得启动子序列,利用生物信息学对序列进行了分析,采用qRT-PCR技术,分析了SpLEA1基因在干旱胁迫下的表达模式。结果表明:(1)垫状卷柏SpLEA1全长为476 bp,开放阅读框(ORF)为279 bp,共编码92个氨基酸,通过在线工具预测到蛋白分子量为9 491.46 Da, 等电点为5.45,蛋白结构预测分析表明该蛋白为亲水性蛋白,含有10个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。(2)预测到SpLEA1蛋白的保守结构域为Lea-5,来源于LEA1家族,基于系统发生树和遗传距离矩阵,发现垫状卷柏SpLEA1与来自鹰嘴豆(Cicer arietinum )和红三叶(Trifolium pratense)的Lea-5蛋白同源性较高。(3)利用在线工具对启动子序列进行顺式作用元件的预测分析发现SpLEA1基因启动子含有5类激素响应元件和与干旱胁迫响应有关的功能元件。(4)在自然干旱处理下SpLEA1基因表达上调并在12 h时达到峰值,在24 h干旱后进行复水处理,表达量显著下调。综上所述,SpLEA1基因在垫状卷柏中很可能参与了干旱胁迫响应机制的相关调控。此结果为进一步研究垫状卷柏SpLEA1基因在干旱胁迫下的功能及其表达调控机制奠定了基础。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2019-02-25 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 在夏枯草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术获得该基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同组织及不同外源性物质诱导下的表达量。克隆得到的PvDXS基因开放阅读框2181 bp,编码726个氨基酸,理论分子量为78 040.47 D,等电点为6.75,PvDXS 蛋白具有Transketolase_C 结构域和Transket_pyr 结构域,系统进化树结果表明,PvDXS 蛋白与丹参、长春花的DXS(SmDXS2、CrDXS2)亲缘关系较近,推测PvDXS 属于第II 类DXS 蛋白。qRT-PCR 分析表明,PvDXS 基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高,其它6种外源性物质处理后表达量均降低,其中CaCl2、SNP、SA处理后该基因的表达量显著降低。PvDXS基因在不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达,该研究结果为进一步研究PvDXR基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础
分类: 生物学 >> 动物学 提交时间: 2017-10-10 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要: 本试验旨在克隆、鉴定猪硒蛋白P基因(Sepp1),并探明其在猪不同组织中的mRNA相对表达量,为以猪为模型研究硒蛋白P(SelP)的功能奠定基础。根据表达序列标签(EST)序列设计引物,利用cDNA末端快速克隆(3′-RACE)技术从猪肝脏总RNA中扩增出含开放阅读框(ORF)至polyA片段,然后与EST序列进行拼接;采用荧光定量PCR技术考察Sepp1在猪9个组织中的mRNA相对表达量。结果显示:1)扩增出共1 707 bp的片段,测序后与EST拼接获得了2 109 bp的猪Sepp1序列,并提交至NCBI GenBank数据库,序列号为EF113596.2;该基因1 170 bp的ORF编码区和对应的氨基酸残基与人相应序列分别有83.72%和75.64%序列同源性,其编码390个氨基酸,含有14个硒代半胱氨酸(Sec)残基,分别位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位。2)Sepp1 mRNA在猪组织中广泛分布,在肝脏中具有最高分布,依次为甲状腺>肾脏>睾丸>下丘脑>脾脏>垂体>心脏>肌肉。本试验成功克隆、鉴定了猪Sepp1,检测了其在猪不同组织中表达分布情况,为其进一步以猪为模型探讨其功能奠定了基础。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2019-08-27 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,本实验在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录 PCR 技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用 qPCR 法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS 基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3 处理组该基因表达量升高。PvGGPPS 基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS 基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。
分类: 生物学 >> 动物学 提交时间: 2018-12-20 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要: 本试验旨在制备高纯度和特异性的牛奶乳铁蛋白多克隆抗体,为鉴定并定量检测牛奶样品中及奶牛乳腺组织中合成的乳铁蛋白提供试验材料。选用4只健康新西兰大白兔,初次免疫乳铁蛋白4周后进行加强免疫,每2周加强免疫1次,待血清达到抗体效价后,对兔进行心脏采血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。测定纯化后抗体效价,并绘制抗体抑制曲线。最后利用所得抗体对市售液态奶、奶牛乳腺组织匀浆液、奶粉样品中的乳铁蛋白进行定量检测。结果表明,本试验制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体纯度较高、特异性较强,抗体浓度为11.02 mg/mL,效价达到1:128 000;采用该抗体测定的乳腺组织样品中乳铁蛋白浓度为16.13 μg/g,液态奶中接近于0 μg/g,奶粉中为5.28 μg/g。总之,本试验采用经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高、特异性较强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体,可以用于牛奶等产品的乳铁蛋白鉴定。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 摘要 目的:克隆获得家蚕(Bombyx mori)Bmtol基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在组织和JHA处理后头部的表达差异,为该基因的功能研究提供参考。方法:以家蚕的全组织cDNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Bmtol基因cDNA全长序列,并提交至GenBank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MREGA5.0软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建BmTOL及其它昆虫同源TO的进化树;通过qPCR技术分析Bmtol基因在5龄3天家蚕不同组织的表达情况,及JHA处理5龄蚕后在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h家蚕头部的表达情况。结果:克隆获得了家蚕Bmtol基因的cDNA序列(GenBank审查中),Bmtol基因的开放阅读框(ORF)长度为759 bp,编码252个氨基酸,预测其蛋白分子量为27.72 KD,理论等电点为6.16,有信号肽,无跨膜结构,且第25—251位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域;N端为疏水区域,可能与保幼激素结合蛋白的核心部位有关。亚细胞定位分析表明,BmTOL属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。BmTOL蛋白具有3个α螺旋,第34位的Cys和第44位Cys形成一个二硫键链接在α1螺旋和N末端,构成BmTOL蛋白与配体结合的核心部位。序列比对结果显示,家蚕BmTOL序列与其他昆虫TO的氨基酸序列一致性差别较大。家蚕BmTOL与果蝇DmTO的相似性为25.10%,与烟草烟草天蛾的相似性为19.69%,与冈比亚按蚊的相似性为25.78%,与埃及伊蚊的相似性为23.53%,与黑花蝇的相似性为28.17%,与意大利蜜蜂的相似性为23.05%,与苹浅褐卷蛾的相似性为21.18%。系统进化树分析表明,所有选用昆虫TO形成两个大的分支:苹浅褐卷蛾EpTO1、烟草天蛾MsTO、意大利蜜蜂AmTOL、果蝇DmTO和黑花蝇PrTOL聚为一个分支,埃及伊蚊AaTO、冈比亚按蚊AgTOL-2和家蚕BmTOL聚为另一大分支。qPCR结果显示,Bmtol基因在家蚕头部、表皮和精巢有较高表达,其他组织表达量很低或没有。在JHA处理的5龄家蚕的头部,Bmtol基因在处理后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h的表达量差异不明显。结论:BmTOL蛋白属于JHBP家族,具有JHBP家族的典型结构;组织表达谱和JHA处理结果暗示,BmTOL属保幼激素结合蛋白(JHBP),在家蚕中除保幼激素结合之外还参与其他多种生理功能。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 随着基因工程技术的快速发展,通过对不同菌株腈水解酶基因的分析,将其克隆到表达菌株内,可以构建高效并且稳定的基因工程菌。对腈水解酶进行分子改造可以明显提高酶的活性、稳定性、底物耐受性和底物特异性等性能,为腈水解酶的工业化应用提供了可能。综述了腈水解酶的来源、结构、催化机理、克隆表达、固定化及分子改造等方面的研究进展。同时对腈水解酶的研究进行了展望,具有重要的指导意义。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2023-08-04 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 干旱和土地盐渍化是制约林业可持续发展的重要因素,植物在遭受生物或非生物胁迫时,会在叶 片释放萜类等挥发性物质。1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是 MEP 途径的末端活性酶, 具有提供前体萜类物质和主要限速作用。为探究马尾松 HDR 基因是否参与干旱和盐胁迫条件下的胁迫响 应,该研究克隆了马尾松 HDR 基因开放阅读框,并初步分析了其生物信息、组织特异性表达水平和功能。 结果表明:(1)PmHDR 基因编码区长度为 1 458 bp,编码 485 个氨基酸,其编码蛋白包含 LytB/IspH 基 因超家族的核心序列和 PLN02821 多功能结构域,属于 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶家族。 (2)PmHDR 密码子使用偏好性较弱,偏好使用 A/U 结尾的密码子,烟草、拟南芥与酿酒酵母更适合作为 其异源表达受体。(3)qRT-PCR 结果显示,PmHDR 基因在马尾松老叶中表达量最高,其次为幼叶、幼茎 和老茎,在根中表达量最低。(4)构建基因表达载体 pBI121-PmHDR 并转化拟南芥,转基因拟南芥对干 旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性。以上研究结果表明 PmHDR 参与植物干旱和盐胁迫的响应和调节,该结 果可为马尾松抗逆育种提供一定的理论支持。
分类: 生物学 >> 植物学 提交时间: 2022-10-27 合作期刊: 《广西植物》
摘要: G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白2(G2/mitotic-specific cyclin-2,Msc2)作为高等 植物应对逆境胁迫的关键调控蛋白,参与多个抗逆境胁迫的应答。为探究RcMsc2 基因的功 能,该研究从蓖麻叶片组织中成功克隆了RcMsc2,并利用生物信息学分析RcMsc2 蛋白的 结构和潜在功能,同时借助qRT-PCR 方法分析RcMsc2 基因的组织表达特性和非生物胁迫 表达特性。结果表明:(1)RcMsc2 基因位于蓖麻第5 号染色体长臂,该基因的CDS(coding sequence)区是1 299 bp,编码432 个氨基酸。(2)RcMsc2 蛋白拥有细胞周期(cyclin)家 族特征结构域,是一个不稳定酸性亲水蛋白,无跨膜域和信号肽,相对分子量是49.38 kD。 (3)RcMsc2 蛋白的二级、三级结构以-螺旋和无规则卷曲为主。(4)RcMsc2 蛋白与麻风 树和巴西橡胶树的CYCB2 蛋白的序列同源性最高,且同被聚为Group Ⅱ。(5)RcMsc2-GFP 融合蛋白定位于细胞核。(6)RcMsc2 基因在蓖麻的所有组织中均有表达,且主要在根和茎 中发挥作用;非生物胁迫分析表明RcMsc2 基因可以被脱落酸(abscisic acid, ABA)、盐、 干旱和低温处理诱导表达,并且RcMsc2 基因对低温胁迫的响应最敏感。综上,该研究较全 面地分析了RcMsc2 基因的结构特征、系统进化和表达模式,为揭示RcMsc2 基因在蓖麻的 生长发育和应答冷胁迫过程中的功能提供理论参考。
分类: 计算机科学 >> 计算机科学的集成理论 提交时间: 2019-01-28 合作期刊: 《计算机应用研究》
摘要: 针对现有的RFID认证协议在安全认证过程中,由于协议的设计的缺陷,导致的协议安全性不足的问题,提出了一种利用同步化随机数以及PUF改进的轻量级RFID认证协议。首先提出了一种对RFID协议的去同步化攻击方法,并分析其原因;然后通过在标签和读写器两端设置一个同步化随机数,增强协议抗去同步化攻击的能力;最后,在标签中引入了PUF,通过PUF的不可克隆性提高了标签密钥的抗攻击能力。分析结果表明,新协议能有效地抵抗多种攻击,在保证一定效率和开销的同时具有更高的安全性。
分类: 医学、药学 >> 基础医学 提交时间: 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要: 目的 克隆人CD45 cDNA并导入Hela细胞中表达,建立研究CD45功能的细胞模型。方法 采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增CD45基因PTPRC的cDNA,将其克隆至pMD-18T载体。构建重组真核表达载体PcDNA3.1-3xflag-CD45,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切及测序验证。将其转染至Hela细胞,以流式细胞术(FCM)和免疫印迹(WB)分析CD45在Hela细胞中的表达情况,碱性磷酸酶试剂盒检测CD45的活性。结果 分离到长约3900 bp的人PTPRC cDNA片段,将其插入pMD-18T载体获得了cDNA克隆。酶切和测序结果证实重组表达载体PcDNA3.1-3xflag-CD45构建成功,FCM和WB分析表明CD45能在Hela细胞中有效表达,且表达的重组CD45蛋白具有生物学活性。结论 成功获得人PTPRC cDNA克隆并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究CD45功能奠定了基础。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2022-04-29 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 为探究葛根品种间异黄酮类物质代谢关键酶基因 PtCHI 分子机制差异,以初步揭示 其品种间异黄酮物质含量差异原因。该研究分别以野葛品种和粉葛品种“桂葛 1 号”为材料, 经乙醇提取并通过高效液相对野葛和粉葛中葛根素和总黄酮的含量进行测定;基于已报道的 野葛 CHI 基因,通过同源克隆方法分离粉葛中 PtCHI 基因,并在体外进行蛋白表达,同时 在拟南芥原生质体中研究 PtCHI 基因的定位。结果表明:(1)野葛中的葛根素含量显著高 于粉葛,且野葛的总黄酮含量也高于粉葛但不达显著水平;(2)成功分离粉葛 PtCHI 基因, 长度为 742 bp 且包含 672 bp 完整的 ORF 框,编码 223 个氨基酸,与野葛的 CHI 基因具有 99%的同源性;(3)CHI 基因在粉葛中的表达量为茎>根>叶子,野葛中则为根>茎>叶子; 此外除了叶子,野葛中的CHI 基因的表达量均显著高于粉葛;(4)预测为稳定的亲水性蛋 白且大小为 27.8 kD,二、三级结构以α-螺旋为主,具有 25 个磷酸化位点,与野葛、大豆和 乌拉尔甘草的亲缘关系较近,和 F3H2、F3H、4CL4、DFR2 及 CHS 发生互作的可能性较大; (5)在体外成功诱导并分离到 27.8 kD 的 PtCHI 单一蛋白;(6)通过拟南芥原生质体进一 步揭示 PtCHI 主要定位在叶绿体。该研究为进一步解析粉葛和野葛中的黄酮类物质含量差 异的问题,以及 PtCHI 的功能验证和异黄酮代谢途径机理研究奠定基础。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2021-05-27 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata L.)合适的不同生长期不同组织 RT-qPCR 内参基因,利用同源克隆法克隆斑地锦 GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP 等基因片段,RT-qPCR检测 7 个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,geNorm、 NormFinder 和 BestKeeper 等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果显示:克隆的 GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP 基因片段为 729、808、753、422、 233、656、313 bp,分别编码 242、269、250、140、77、218、103 个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在 85%以上。综合 3 个分析软件对各生长期不同组织中表达 稳 定 性 进 行 的 评 价 得 出 , 表 达 稳 定 性 排 名 为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取 UBQ 作为斑地锦 RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。
分类: 生物学 >> 植物学 提交时间: 2018-03-26 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 该研究采用同源克隆和3'RACE技术,从白及(Bletilla striata )中获得与热激蛋白合成有关的BsHsp17.3基因,并分析BsHsp17.3基因对不同胁迫的响应,探索人工栽培白及的适宜条件。结果表明:BsHsp17.3基因开放阅读框长度为453 bp,编码150个氨基酸;蛋白的分子量为17.42 kD,等电点为6.33;进化树分析表明,BsHSP17.3蛋白与同为兰科的铁皮石斛进化关系较近,同在一分支上。半定量RT-PCR分析显示,BsHsp17.3基因在白及根、叶、鳞茎及花组织中的表达具有特异性,且BsHsp17.3基因在叶中的表达量较高,在鳞茎及花中不表达。实时荧光定量PCR检测显示,BsHsp17.3对非生物胁迫高温、低温具有明显应答反应,20%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,推测该基因在白及防止倒苗过程中可能发挥一定作用。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2021-08-09 合作期刊: 《广西植物》
摘要: UDP-类黄酮 3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)是花青素生物合成途径的重要催化酶之一。为研究其在紫玉兰花青素苷合成途径中的作用,该文以紫玉兰品种‘红元宝’(Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’)为材料,根据转录组测序获得的 3GT 序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆花青素苷生物合成途径中的结构基因 Ml3GT1,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明:(1)Ml3GT1 基因的 cDNA 序列长度为 1 863 bp,其中最长开放阅读框(ORF)为 1 374 bp,编码一条 457 aa 的肽链,相对分子质量为 49.37 kDa,理论等电点(pI)为 6.04。(2)氨基酸序列比对显示其具备典型的植物次生产物糖基转移酶信号序列(PSPG box)。(3)系统发育分析结果表明,Ml3GT1 蛋白与小苍兰、矮牵牛、番薯等物种的 3GT 蛋白聚在一支。(4)qRT-PCR 结果显示 Ml3GT1 基因的表达具有时空特异性,在花中的表达量最高,在嫩叶和老叶中有少量表达,而在根和茎中几乎不表达;且随着花的发育,Ml3GT1 基因的表达量呈现先降低后升高的趋势,并在盛花期达到最高。上述结果表明,Ml3GT1 可能参与类黄酮 3-O 的糖基化修饰,本研究结果将为木兰属植物花色育种研究奠定基础。
分类: 医学、药学 >> 基础医学 提交时间: 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要: 目的 制备兔抗弓形虫I型液泡型质子焦磷酸酶(TgVP1)多克隆抗体并鉴定其应用。方法 选择弓形虫ME49株TgVP1氨基酸序列中的两条多肽,TgVP1-1与TgVP1-2,进行人工合成,并将其与KLH偶联作为抗原免疫新西兰大耳白兔,收集血清制备多克隆抗体,并通过ELISA、Western blot、免疫荧光等方法进行鉴定。结果 经间接ELISA测定,兔抗TgVP1-1及TgVP1-2的多克隆抗体效价均达1∶128000;Western blot结果显示两种多抗均能识别弓形虫天然蛋白中85000左右条带,与TgVP1预测相对分子质量大小相符,且特异性较好;通过免疫荧光技术检测到两株多抗识别的蛋白均定位于细胞质中,与酸性钙体的分布相同。结论 采用人工合成多肽为免疫原所获得的兔抗TgVP1多克隆抗体效价高,特异性好,弓形虫TgVP1和酸性钙体的深入研究奠定了基础,同时也为弓形虫病的诊断提供了新的有效工具。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒pET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coil BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDS-PAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43 kDa的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25 ℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75 U/mL,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744 mmol/L,Vmax为0.143 mmol/L/min,相对于ATP的Km值为2.266 mmol/L,Vmax为0.318 mmol/L /min。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒pET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coil BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDS-PAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43 kDa的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25 ℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75 U/mL,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744 mmol/L,Vmax为0.143 mmol/L/min,相对于ATP的Km值为2.266 mmol/L,Vmax为0.318 mmol/L /min。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。
分类: 生物学 >> 动物学 提交时间: 2017-11-07 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要: 本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70 ℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性。除Mn2+外,其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg2+和Cu2+对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。