分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-08-29 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为制备Cancer testis 55（CT55）单克隆抗体，需构建带有人源CT55片段的原核表达质粒，把该质粒转化Rosetta感受态进行原核表达并得到目的蛋白，蛋白被纯化后免疫6w雌性BALB/c小鼠。按传统的单克隆抗体的制备方法，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（sp2/0）进行融合，经ELISA方法筛选及两次连续亚克隆，共获得多株能稳定分泌抗 CT55蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，如3D8B7B12、4C8E1C9、3D8C10G9等。ELISA及Western Blot（WB）分析结果表明，筛选的细胞株均能产生单克隆抗体，且该抗体均分别能与原核表达及真核表达的CT55蛋白发生特异性结合。单克隆抗体可用于免疫荧光试验，且与P53发生互作的荧光主要位于细胞核边缘。结果表明，本研究成功制备了针对人源CT55 蛋白的单克隆抗体。CT55蛋白单克隆抗体的制备为今后肝癌、胃癌、结肠癌等癌症的快速的病原学诊断以及 CT55蛋白的结构和功能研究奠定了物质基础。
分类： 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间： 2022-04-29 合作期刊: 《广西植物》
摘要： 为探究葛根品种间异黄酮类物质代谢关键酶基因 PtCHI 分子机制差异，以初步揭示 其品种间异黄酮物质含量差异原因。该研究分别以野葛品种和粉葛品种“桂葛 1 号”为材料， 经乙醇提取并通过高效液相对野葛和粉葛中葛根素和总黄酮的含量进行测定；基于已报道的 野葛 CHI 基因，通过同源克隆方法分离粉葛中 PtCHI 基因，并在体外进行蛋白表达，同时 在拟南芥原生质体中研究 PtCHI 基因的定位。结果表明：（1）野葛中的葛根素含量显著高 于粉葛，且野葛的总黄酮含量也高于粉葛但不达显著水平；（2）成功分离粉葛 PtCHI 基因， 长度为 742 bp 且包含 672 bp 完整的 ORF 框，编码 223 个氨基酸，与野葛的 CHI 基因具有 99%的同源性；（3）CHI 基因在粉葛中的表达量为茎>根>叶子，野葛中则为根>茎>叶子； 此外除了叶子，野葛中的CHI 基因的表达量均显著高于粉葛；（4）预测为稳定的亲水性蛋 白且大小为 27.8 kD，二、三级结构以α-螺旋为主，具有 25 个磷酸化位点，与野葛、大豆和 乌拉尔甘草的亲缘关系较近，和 F3H2、F3H、4CL4、DFR2 及 CHS 发生互作的可能性较大； （5）在体外成功诱导并分离到 27.8 kD 的 PtCHI 单一蛋白；（6）通过拟南芥原生质体进一 步揭示 PtCHI 主要定位在叶绿体。该研究为进一步解析粉葛和野葛中的黄酮类物质含量差 异的问题，以及 PtCHI 的功能验证和异黄酮代谢途径机理研究奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件，分析重组蛋白的抗真菌活性。方法：比较不同的诱导温度(25 ° C, 28 ° C, 30 ° C, 32 ° C, 34 ° C)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度（0.025、 0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0mmol·L-1）和诱导时间（12h、15h、18h、21h、24h）对AMPs17重组蛋白表达量的影响，筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件；采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析，Western bolt对AMPs17重组蛋白鉴定，高效液相色谱分析重组蛋白的纯度，微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果：在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0.05mmol·L-1的条件下诱导培养15h，AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定；HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90％以上；优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论：本研究优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件，获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白，为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。
分类： 生物学 >> 植物学 提交时间： 2022-10-27 合作期刊: 《广西植物》
摘要： 花粉类受体蛋白激酶（pollen receptor like kinase，PRK）是一类富 LRR 结构域的类 受体蛋白激酶，不仅在花粉发育和植物受精中发挥作用，也在胁迫响应中发挥作用。基于 对前期花生根尖铝胁迫转录组数据的分析，我们发现了在转录水平响应铝胁迫的花粉类受 体蛋白激酶基因 AhPRK4，为探究 AhPRK4 在花生铝胁迫中的功能，该文进一步分析了铝 胁迫处理下 AhPRK4 在花生耐铝品种99-1507和铝敏感品种中花 2 号（ZH2）根尖中的 转录变化，通过序列分析、进化树构建等分析了 AhPRK4 的蛋白结构特点和亲缘关系，克 隆了 AhPRK4 的胞内域序列（AhPRK4-CD），并通过原核表达和体外磷酸化体系分析了 AhPRK4-CD 的自磷酸化活性。结果表明：（1）不同铝处理时间及不同铝浓度处理后， AhPRK4 的转录水平上调，显著响应铝处理，是铝诱导基因；（2）AhPRK4 含有 673 个氨 基酸，属于 LRR-III 蛋白激酶家族成员，具跨膜域和信号肽，且预测具有磷酸化活性位点； （3）体外诱导表达出约 71 kD 的可溶性蛋白（GST-AhPRK4-CD），经凝胶亲和层析纯化， 得到基于蛋白印迹实验（Western Blot）验证正确的重组蛋白，重组蛋白可发生磷酸化修饰， 但无明显的自磷酸化现象。综上认为，AhPRK4 是一个铝胁迫应答基因，参与花生铝胁迫 早期应答机制，且能发生磷酸化修饰。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-09-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：构建携带金黄色葡萄球菌类肠毒素K（Staphylococcal Enterotoxin-like K, SElK）和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的工程菌，并对SElK-GFP融合蛋白进行初步生物学活性分析。方法：利用PCR和Overlap PCR克隆获得SElK-GFP融合基因，并插入pET28a表达载体中，通过菌落PCR，质粒双酶切及测序验证后，将构建成功的pET28a-SElK-GFP质粒转化到E.coli BL21菌株中进行诱导表达，通过 Ni+亲和磁珠试剂盒纯化获得SElK-GFP融合蛋白；并利用MTT法检测SElK-GFP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖；ELISA法检测SElK-GFP尾静脉注射后小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。结果：成功构建能够表达SElK-GFP融合蛋白的工程菌，纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白可观测到明显的绿色荧光，融合蛋白生物学活性分析表明，SElK-GFP能够呈剂量依赖性地显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖；同时ELISA检测发现SElK-GFP可显著增加小鼠血清中细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌水平。结论：本研究成功克隆、表达及纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白，其不仅保留了SElK的超抗原活性，同时兼具GFP绿色荧光的可视性，为深入研究SElK生物学活性提供有利工具。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究一种小分子量类弹性蛋白标签（elastin-like protein tag，ELP tag）——ELP30-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法：人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体，结合2种内含肽（intein1和intein2）基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）基因，构建4个含有不同元件序列的原核表达载体：pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP30；将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导重组蛋白表达，并通过可逆相变循环（inverse transition cycling，ITC）纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30，随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）分别诱导intein1和intein2断裂，最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果：利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP和eGFP-intein2-ELP30；重组蛋白ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP，但未能分离获得纯eGFP。本研究为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究一种小分子量类弹性蛋白标签（elastin-like protein tag，ELP tag）——ELP30-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法：人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体，结合2种内含肽（intein1和intein2）基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）基因，构建4个含有不同元件序列的原核表达载体：pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP30；将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导重组蛋白表达，并通过可逆相变循环（inverse transition cycling，ITC）纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30，随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）分别诱导intein1和intein2断裂，最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果：利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP和eGFP-intein2-ELP30；重组蛋白ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP，但未能分离获得纯eGFP。本研究为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。
分类： 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间： 2020-08-02 合作期刊: 《广西植物》
摘要： 病程相关蛋白（PRs）在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10（GenBank：KF673356）来自盐穗木（Halostachys capsica）在600 mmol·L-1 NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制，通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白，制备特异性的HcPR10多克隆抗体。本研究采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10，转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21诱导表达，通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白，分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明：成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10；正交结果显示诱导温度27 ℃，诱导转速200 r·min-1，IPTG浓度0.7 mmol·L-1，诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白；ELISA检测抗HcPR10血清效价达1:243 000，Western Blotting印迹结果显示制备的抗血清可以与重组蛋白和转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）中异源表达的HcPR10蛋白特异性结合。获得了效价高、特异性强的盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清，为进一步研究HcPR10的亚细胞定位及生物学功能奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： β2糖蛋白Ⅰ ( beta 2- glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ ) 是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS) 血清中抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)的主要抗原。β2GPⅠ 通过第五结构域与阴性磷脂oxLDL结合，进而被aPL识别，是APS动脉血栓发生的关键事件。本研究构建了编码β2GPⅠ第五结构域（ß2GPⅠ-DⅤ）、ß2GPⅠ-DⅤ突变体及ß2GPⅠ-DⅤ的Phe280-Ala320片段的原核表达载体，对其进行诱导表达和纯化，解析了ß2GPⅠ-DⅤ与阴性磷脂结合的分子机制，结果表明，β2GPI-DV中Cys281-Cys288以及Ser311-Lys317区段在空间上维持一定构型是与CL结合所必须的前体条件，而C245-C296，C288-C326两个二硫键在维持二者空间构型方面起到一定的作用。在此基础上，我们进一步检测了具有结合CL生物学活性的rDV结合oxLDL以及APS血清中oxLDL的活性，表明rDV具有与天然β2GPⅠ相一致的生物学活性。本研究获得的rß2GPⅠ-DⅤ，以及与oxLDL结合的方法体系的建立，为APS早期实验室诊断奠定基础。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的构建经MHC且通路的屋尘瞒1类变应原Der p 1的T细胞表位肤疫苗重组载体。方法分别合成丁AT ,IhC和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核昔酸序列，用特异性引物PCR扩增相应的基因片段，分别用相应的双酶切后，用T4 DNA连接酶连接形成TAT-IhC-Der P 1-3T融合基因，并插入至原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组原核表达载体pET-28a(+)-TAT-IhC-DerP 1-3T,Bam, H I和Xh} I进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E. c}li BL21(DE3)菌株，IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证，纯化丁AT-IhC-Der p 1-3T蛋白后进行IgE结合试验。结果双酶切和测序结果表明，成功构建了pET-28a-TAT-IhC-DerP 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-IhC-DerP 1-3T可诱导表达; Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;IgE结合试验表明丁 AT-IhC-Der p 1-3T结合屋尘瞒过敏病人血清IgE的能力强于Der p 1变应原((P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组pET-28a-TAT-IhC-DerP]一刃载体，纯化的丁AT-IhC-Der p 1-3T具有较强的IgE结合能力，从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
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