分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)介导的骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)基因沉默对钙盐诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响及机制，为钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease，CAVD）的干预及治疗提供理论依据。 方法：非CAVD瓣膜组织(non-CAVD组)取自手术治疗的主动脉夹层患者，CAVD瓣膜组织(CAVD组)取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行主动脉瓣膜置换术的患者，采用免疫组化和Western blot法检测non-CAVD组和CAVD组中BMP7、Runt相关转录因子2(Runx2)的蛋白表达水平。选取健康家猪处死后即刻于无菌条件下取主动脉瓣叶，采用胶原酶连续消化法分离主动脉瓣膜间质细胞，观察其形态特征，并用免疫荧光染色行表型鉴定。采用脂质体转染法将BMP7-siRNA转染猪主动脉瓣膜间质细胞，采用qPCR和Western blot法验证BMP7表达的变化;利用钙盐培养基诱导细胞成骨分化，建立体外主动脉瓣膜间质细胞钙化模型后，采用ALP染色和茜素红S染色实验分别检测细胞早期及晚期成骨分化能力;采用qPCR和Western blot法分别检测细胞成骨相关基因及蛋白Runx2、OCN和OPN的表达情况。并用Western blot法检测BMP7下游信号通路中Smad1/5/8的磷酸化水平。结果：BMP7和Runx2蛋白在CAVD组中表达明显高于non-CAVD组。成功分离出原代猪主动脉瓣膜间质细胞，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及波形蛋白（vimentin）染色阳性，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）染色阴性。转染BMP7-siRNA后猪主动脉瓣膜间质细胞中BMP7的mRNA和蛋白水平均明显下调，早期及晚期成骨分化能力均明显降低。沉默BMP7基因的表达，可下调Runx2、OCN和OPN的基因及蛋白表达，且磷酸化的Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)蛋白水平明显降低。结论：BMP7基因沉默抑制钙盐诱导的主动脉瓣膜间质细胞的成骨分化能力，BMP7/Smads信号通路可能在该过程中发挥重要作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：本文旨在探讨糖酵解酶丙酮酸激酶M2型（PKM2）对人白血病细胞体外增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法：将靶向PKM2的慢病毒载体转染人K562细胞株（shPKM2组），同时设立空载体转染组为对照（Vector组）。采用qRT-PCR和Western blot技术分别检测Vector组和shPKM2组PKM2 mRNA和蛋白的表达以及自噬标志物的变化；CCK-8实验检测细胞体外增殖能力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平。结果：在稳定干扰PKM2后，PKM2的mRNA（t=11.58，P=0.0003）和蛋白水平（t=11.88，P=0.0003）均明显降低。与Vector组比较，shPKM2组细胞体外增殖能力显著降低（F=118.87，P＜0.0001）。同时，干扰PKM2可使K562细胞周期阻滞在G1期，细胞凋亡率显著增加（t=37.23，P＜0.0001）；使促凋亡蛋白Bax表达增加（t=15.36，P=0.0001）、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低（t=9.965，P=0.0006）。此外，干扰PKM2可减弱K562细胞自噬水平，表现为LC3II降低（tLC3II=10.32，PLC3II=0.0005），而p62水平增加（tp62=14.59，Pp62=0.0001）。还发现自噬诱导剂能逆转shPKM2引起的白血病细胞体外增殖能力减弱（F=96.32，P＜0.0001）。结论：以上结果表明干扰PKM2可抑制人白血病K562细胞的体外增殖并促进其凋亡，其机制可能与PKM2介导的自噬活性降低有关，提示PKM2可能作为白血病诊疗的一个潜在靶点。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-10-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探讨微环境中钙周期素S100A6 是否通过影响巨噬细胞（macrophages, Mφ）进而促进结直肠癌（colorectal cancer, CRC）细胞的增殖及其机制。方法：制备（原核表达）并鉴定带GST（glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-转移酶）标签的人重组S100A6蛋白(recombinant GST-hS100A6，rS100A6) 和对照蛋白GST；采用台盼兰计数、CCK8和结晶紫染色检测CRC细胞系HCT116的增殖能力；用定量实时聚合酶链反应检测Mφ中IL-6 mRNA水平；用Western blot检测Mφ中IL-6的蛋白水平、HCT116细胞中JAK2和STAT3及其磷酸化水平。 结果：（1）成功制备rS100A6和GST蛋白。（2）与经rS100A6处理的Mφ（即A6-Mφ）共培养后，HCT116细胞的增殖能力增强（P<0.05）；同时，HCT116细胞中的JAK2和STAT3水平无明显变化，但其磷酸化水平提高（P<0.05）。（3）A6-Mφ中，IL-6的mRNA和蛋白水平均升高（P<0.05）。（4）在HCT116与A6-Mφ的共培养体系中加入IL-6R封闭肽后，A6-Mφ促HCT116细胞的活力和增殖能力的作用被部分逆转（P<0.05）。 结论：微环境中的S100A6可通过上调巨噬细胞中IL-6的表达、进而激活HCT116细胞中IL-6/JAK2/STAT3信号通路来促进CRC细胞的增殖。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-10-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探讨长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖，迁移与侵袭的影响。方法：构建SNHG3过表达质粒，实验分别设置阴性对照组(pcDNA-3.1+)与SNHG3基因过表达组(pcDNA-3.1+/SNHG3)。将MCF-7细胞转染对照组质粒和SNHG3过表达质粒，采用实时定量PCR 方法检测 SNHG3 mRNA 转录水平，Western blot 检测MMP9及EMT相关蛋白水平；集落形成实验检测MCF-7细胞增殖能力；划痕愈合实验检测MCF-7细胞横向迁移能力； Transwell 小室实验检测MCF-7细胞纵向迁移能力及侵袭能力；结果：过表达SNHG3后，MCF-7细胞中SNHG3的mRNA水平显著增高（P<0.001）；MCF-7细胞的体外增殖能力明显增加（P<0.01），迁移（P<0.01）与侵袭能力（P<0.001）也显著增强，实时定量PCR， Western blot 结果显示SNHG3可激活EMT相关通路。结论: 过表达SNHG3可能通过激活EMT通路促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖,迁移与侵袭。
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