分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的通过相关信号通路屏蔽和基因表达分析，探讨甲状旁腺素((PTH)非PLC依赖PKC信号转导途径(PTH/nonPLC/PKC)的功能，分析其对骨代谢的影响。方法取2-3 d C57BL乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞，取贴壁生长的第1代细胞，随机分为4组:100 nmol/L [Glyl, Arg19] hPTH(1-28)(简称GR(1-28))+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L [Glyl, Arg19]hPTH(1-34)(简称GR(1-34))+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L PTH(1-34)及空白对照组加入等体积的0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)，作用4h后，提取各组总RNA，行小鼠全基因组表达谱芯片分析，筛选出可能与nonPLC/PKC信号转导通路相关的差异表达基因，并进行相关通路分析。RT-PCR筛选及验证上述差异表达基因。培养MC3T3-E 1细胞，分为4组:GR(1-28)+RP-cAMP; GR(1-34)+RP-cAMP; GR(1-34)+RP-cAMP+100 nmol/L Go6983及空白对照组，RT-PCR法验证比较GR(1-28)和GR(1-34)引起的基因表达变化情况。结果倒置相差显微镜观察示，培养7d见细胞排列紧密，为三角形或多边形，呈铺路石样;细胞培养14 d ALP染色可见胞质中出现蓝染颗粒，成骨诱导培养28 d茜素红染色可见红色矿化结节形成。基因芯片分析结果中筛选出与PTH的nonPLC/PKC信号转导通路相关性最大的56个基因，进行RT-PCR验证后发现CITEDI的表达量在GR(1-34)+RP-cAMP组显著高于GR (1-28)+RP-cAMP组及空白对照组，但小于PTH(1-34)组(P<0.05 ) } MC3T3-E1细胞RT-PCR验证的结果与其一致，在阻断cAMP/PKA信号通路后，仅CITEDI基因表达量在GR(1-28)和GR(1-34)刺激时存在显著不同，且加入PKC抑制剂(Go6983)后，表达差异消失。结论PTH的nonPLC/PKC信号转导通路的激活能够使得成骨细胞CITEDl的表达量明显升高，介导PTH对成骨代谢的作用。该途径不依赖PLC和PKA信号的激活。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-27 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 观察甲状旁腺激素的非依赖PLC的PKC转导通路（PTH/nonPLC/PKC）是否会对成骨细胞（MC3T3-E1）的凋亡以及细胞数量具有影响。方法 培养MC3T3-E1细胞，以1.5×104密度接种到96孔板，然后置于培养箱培养3 d直到细胞达到汇合状态，随机分为5组：按 100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）；100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）；100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）+1 μmol/L Go6983，1 μmol/L Go6983；空白对照组加入等体积的去离子水，分别刺激细胞1、24、48 h，然后使用细胞计数试剂盒（CCK-8）和Caspase-Glo® 3/7试剂盒（caspase-3）检测细胞的细胞数量与凋亡。结果 CCK-8检测结果显示，［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）+Go6983组相比，在1 h和24 h具有提高细胞数量的趋势，但结果并没有统计学差异，48 h［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）组相比，可以明显提高细胞的数量（P<0.05）。进一步的研究发现在［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组添加抑制剂Go6983后，细胞数量增多的效应消失（P<0.05）。Caspase-3检测凋亡结果显示，［Gly1,Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）+Go6983组相比，在1 h和24 h具有抑制细胞凋亡（细胞凋亡受到抑制），但是差异无统计学意义。48 h检测细胞凋亡显示，［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）组相比，前者可以明显抑制细胞凋亡（P<0.05），给予PKC抑制剂Go6983后，其抑制凋亡现象消失。结论 PTH的nonPLC/PKC信号转导通路可能在长时间（48 h）作用于MC3T3-E1细胞时，可抑制细胞凋亡，提高细胞的数量。
点击量
点击量
下载量
评论
