关键词: 6-羟基烟酸3-羟化酶; 酶学性质; 催化机理; 同位素标记;
提交时间： 2019-04-21
摘要： 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440中的6-羟基烟酸（6HNA）3-单加氧酶（NicC）是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行了活化，从而使得吡啶环可在双加氧酶催化下开环最终被完全降解。本研究通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量，进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现，NicC的最适反应温度为30℃-40℃，最适反应pH为8.0。Cd2+离子对于NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25 mM的时候，底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1 U/mg，Km值为51.8 μM；当6HNA的浓度为0.25 mM的时候，底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79 U/mg，Km值为15.0 μM。通过HPLC和LC-MS分析表明，NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）和甲酸，另外可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。该研究为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。
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提交时间： 2019-03-05
摘要：目的：利用新型纳米森林材料，构建一种操作简单、检测快速、灵敏度高的用于现场检测的自驱动微流控芯片。方法：利用MEMS加工技术制备出具有优良光学性能和大表面积的石英纳米森林结构微流道，对该纳米森林结构的高度、宽度/横向尺寸、密度、表面积、光学性能、毛细驱动效果、荧光增敏效果做出评价,利用双抗体夹心的方法进行蓖麻毒素的检测。结果：纳米纤维锥底直径约200~300nm，高度约1.0um，纳米森林的密度约为10个/μm2，估测表面积比底面积达5:1以上。其在波长为680nm处的透光率达89.5%，驱动流速约5mm/s，与平面结构相比，其饱和荧光显色成倍提高。蓖麻毒素的检测限低于10 pg/ml，在 10~6250pg/ml范围内具有较好线性关系。结论：基于纳米森林结构，成功构建了一种具有超大表面积和高灵敏度的毛细自驱动微流控芯片。
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关键词: 跨国种业企业; 育种技术专利; 品种权; 种业市场份额;
提交时间： 2019-03-05
摘要：跨国种业企业第三次大规模的兼并重组形成了新一轮的国际种业竞争格局，而知识产权保护则是跨国种业公司兼并重组的最大动力之一。研究跨国种业公司并购形成的核心知识产权的积聚重组，更能深度考察国际种业竞争新格局的变化趋势。趋势之一，美日欧三国仍然是全球育种研发创新活动的主导者和垄断者，大规模的兼并重组，实现了技术和资源的整合，提升了国际种业集中度，全球种业42.75%的专利申请量集中在美国、日本和欧盟，并且掌握着全球64.68%的DNA重组技术专利。趋势之二，知识产权已经成为跨国种业公司保持市场竞争优势的有力武器，跨国种业公司是核心种业技术专利的拥有者，拜耳/孟山都、中国化工/先正达和杜邦先锋/陶氏的育种专利申请量占全球总育种专利申请量将近14%，全球农作物的转化体81%以上被跨国种业公司所掌握。对国际种业新格局的变化趋势进行研究分析，可以为我国种业兼并重组提供有价值的政策建议。
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关键词: 毕赤酵母; 去饱和酶; 2A肽; 共表达; fusaruside;
提交时间： 2019-03-05
摘要：目的：构建产fusaruside的毕赤酵母菌株，解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法：从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因—3位去饱和酶（Δ3(E)-SD）和10位去饱和酶（Δ10(E)-SD）基因；并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体，转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达；对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果：3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达，SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48 kDa，10位去饱和酶分子量约为65 kDa；HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论：与fusaruside原产菌株镰刀菌相比，该酵母菌的发酵时间更短，产量更高，为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。
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关键词: 自噬; 结核分支杆菌; miR-17-5p; ATG7;
提交时间： 2019-03-05
摘要：【目的】 通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用，探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。【方法】 生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7，通过成功构建载体ATG7野生型（pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT）和突变型，利用双荧光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系，同时构建结核分枝杆菌（H37Ra）感染的人源性THP-1巨噬细胞模型，将做不同处理的细胞分为三组：miR-17-5p mimics，miR-17-5p inhibitor，miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响，并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。【结果】 MTB感染能够引起miR-17-5p的下调，随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性，双荧光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合，并对其进行负调控。进一步通过Western blot，免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调，自噬小体表达降低，而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较，ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。【结论】 miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬，在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。
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关键词: OTUB1; Cre/Loxp系统; 肝脏特异性基因敲除小鼠; 代谢;
提交时间： 2019-03-05
摘要：目的：建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型，初步分析其表型并研究OTUB1基因与肝脏代谢的关系。方法：利用Cre/Loxp系统构条件性基因敲除小鼠模型，即将OTUB1fl/fl转基因小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代自交，得到OTUB1肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。取同窝对照小鼠（control, NC）和肝特异型基因敲除（hepatic-specific OTUB1 knockout, HCKO）小鼠，通过PCR和免疫印迹（Western blot, WB），确证OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型是否成功构建。通过组织病理学方法，分析主要组织器官的形态以及是否存在自发的病变；通过血清生化指标检测肝脏脂代谢水平；通过血糖耐受实验（GTT）分析HCKO小鼠对血糖的控制。结果：基因组测序和WB检测结果显示HCKO小鼠肝脏中OTUB1被敲除，其他组织中OTUB1表达水平无变化，证明OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型构建成功。HCKO小鼠出生正常，各组织器官无异常，生化指标中总胆固醇水平明显降低，表明OTUB1影响肝脏脂代谢水平。糖耐受实验中HCKO小鼠血糖回落迅速，表明敲除OTUB1影响肝脏血糖调节稳态。结论：应用Cre/Loxp技术成功建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究OTUB1在肝脏的生理功能和调控机制提供了重要的动物模型。
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提交时间： 2019-02-13
摘要：摘要：木聚糖（Xylan）在自然界中的含量极其丰富，在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显，对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶（Xylanase）是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶，近年来，为了实现木聚糖酶的高产、高酶活表达，科研工作者做了大量的研究工作，本文将就木聚糖酶异源表达（Heterologous expression）的研究进展进行综述。 关键词：木聚糖；木聚糖酶；异源表达
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关键词: 毕赤酵母; 胰岛素前体; 发酵工艺; 高产菌株筛选;
提交时间： 2019-02-13
摘要：摘要：以毕赤酵母为异源表达宿主合成人胰岛素前体，在实验室研究和工业生产中已有广泛应用。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子，以甲醇为单一基础碳源进行胰岛素前体的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产过程中，甲醇代谢过程耗氧大、产热高，补料控制工艺复杂，限制了发酵生产的放大。本研究基于我们前期对启动子AOX1的转录调控设计研究，提出以人工设计的高效组成型转录调控器件CSAD_5驱动胰岛素前体基因表达，开发了葡萄糖为碳源的发酵生产工艺，以解决甲醇体系中的产热、耗氧以及工艺控制问题。在此基础上，通过增强筛选压力提高异源基因拷贝，获得了一株胰岛素前体高表达重组毕赤酵母，利用优化的培养工艺在5 L反应器水平发酵生产，胰岛素前体产量在108 h达到1.85 g/L，为目前报道以葡萄糖为碳源，生产人胰岛素前体的最高水平。该研究为胰岛素前体的工业生产以及毕赤酵母的应用提供了新的思路和方法。
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关键词: 高分子囊泡; 药物释放体系; 两亲性嵌段共聚物; 控释; 靶向;
提交时间： 2019-02-13
摘要：摘要：高分子囊泡作为一种新型的纳米药物载体，具有生物可降解性、稳定性、生物相容性以及可修饰的多功能化等特点。改变聚合物种类和亲水-疏水嵌段的比例，可以制备具有不同形态和膜特性的高分子囊泡。经过修饰后的高分子囊泡，可赋予其更多的功能，从而实现药物的控释和药物靶向的能力。本文对高分子囊泡的结构、组成和制备方法以及在药物释放体系的应用等方面进行了较为详细的综述，目的是了解高分子囊泡最新研究进展以及未来科学家们亟需要解决的重要问题。
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提交时间： 2019-01-17
摘要：外泌体是细胞内源性囊泡样生物纳米级膜结构，直径大小在40-100 nm之间，可由各种类型的细胞分泌释放。外泌体具有许多功能，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类的细胞间运输和传递，以及抗原递呈，还可能具有致癌的能力。肿瘤细胞所分泌释放的外泌体在肿瘤的发生、发展以及迁移等生理和病理过程中发挥重要的作用。目前从肿瘤外泌体中寻找特异性标志物已成为肿瘤研究者重点关注的方向，对肿瘤早期诊断、疗效评价和预后分析具有重要的意义。本文作者就近年来外泌体在肿瘤研究和诊断中研究进展进行综述。
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